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以下是本生技術(shù)小編對ELISA試劑盒實驗操作的規(guī)范詳解，結(jié)合雙抗體夾心法的通用流程及注意事項：
一、實驗前準備?
試劑平衡?
試劑盒從冰箱取出后，需室溫平衡20-30分鐘(避免溫度差異影響反應(yīng))?。
設(shè)備校準?
移液器需定期校準，選擇密封性好的槍頭，避免加樣誤差(誤差可超5%)?。
二、加樣規(guī)范?
標準品與樣本處理?
標準品需按說明書渦旋溶解，靜置10-30分鐘至溶解，避免吹打?qū)е碌鞍讚p失?。
樣本需離心(2000×g，15分鐘)去除顆粒物，血清/血漿避免溶血或脂血干擾?。
加樣操作?
垂直懸空加液，避免貼壁或產(chǎn)生氣泡，每孔加樣量需一致(如50μL標準品或樣本)?。
建議設(shè)置復(fù)孔(至少2孔/樣本)，提高數(shù)據(jù)可靠性?。
三、孵育與洗滌?
孵育條件?
37℃恒溫箱孵育60分鐘(雙抗體夾心法)，封板膜密封防止蒸發(fā)?。
震蕩孵育可增強抗原抗體結(jié)合效率(OD值更高)?。
洗滌步驟?
手工洗板：每孔加滿洗滌液(350μL)，靜置1分鐘后拍干，重復(fù)5次?。
機器洗板：檢查沖洗頭是否堵塞，確保洗滌凈。
四、顯色與檢測?
底物反應(yīng)?
加入TMB底物后避光孵育15分鐘，顯色呈藍色?。
終止液加入后5分鐘內(nèi)測定OD值(450nm)，避免延遲導(dǎo)致信號衰減?。
數(shù)據(jù)計算?
標準曲線需線性良好(R2≥0.99)，樣本濃度通過曲線方程計算?。
五、常見問題與解決?
問題? ?可能原因? ?解決方案?
空白孔OD值過高 洗滌不凈或試劑污染 更換新鮮洗滌液，重復(fù)洗板?
平行孔CV值>10% 加樣誤差或孵育溫度波動 校準移液器，使用恒溫箱?
顯色不均勻 底物混合不充分 顯色前充分搖勻試劑?
六、關(guān)鍵注意事項?
試劑保存?：未用完板條需密封干燥保存，濃縮洗滌液結(jié)晶需37℃水浴溶解?。
樣本稀釋?：若說明書要求稀釋樣本(如5倍)，最終結(jié)果需乘以稀釋倍數(shù)?。
以上規(guī)范適用于多數(shù)ELISA試劑盒，具體操作需以試劑盒說明書為準。實驗失敗時建議優(yōu)先檢查加樣精度和洗滌步驟?。
注：以上資料僅供參考，具體其他信息請咨詢技術(shù)老師或品牌供應(yīng)商。
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